На първо място, EcoR1 и Xba1 оставят 5' надвеси, когато усвояват ДНК (както и Nde1). И в двата случая 3' краят е вдлъбнат, поради което полиермазата може да добавя основи. Второ, всички полимерази могат да добавят бази само към 3' края, така че Klenow ще добави 4 бази към отдалечения 3' край на двете места, за да генерира тъпи краища.
Оставят ли рестрикционните ензими 5 фосфат?
Векторите и вложките, усвоени от рестрикционни ензими, съдържат необходимите терминални модификации (5' фосфат и 3' хидроксил), докато фрагменти, създадени от полимеразната верижна реакция (PCR), може да не.
Могат ли тъпите краища да бъдат лигирани?
Лигиране на тъп край
Лигирането на тъп край не включва базово сдвояване на изпъкналите краища, така че всеки тъп край може да бъде лигиран към друг тъп край. Тъпите краища могат да бъдат генерирани от рестрикционни ензими като SmaI и EcoRV.
Так полимеразата произвежда ли тъпи краища?
Yes… Taq Polymerase добавя A-Overhangs, ако поддържате крайната стъпка на удължаване на 72 dC при PCR. Използва се предимно за клониране на TA.
Защо да използвате фрагмент на Klenow в секвенирането на ДНК?
Фрагментът на Klenow е изключително полезен за изследователски задачи като: Синтез на двойноверижна ДНК от едноверижни шаблони . Попълване на отдалечени 3' краища на ДНК фрагменти, за да направи 5' надвеса тъп . Изграждане на стърчащи 3' надвеси.
